Después de recibir elogios por su interpretación actuando junto a Cameron Diaz y Selma Blair en la brillante comedia "La cosa más dulce", la gama de habilidades de Applegate le supuso numerosos papeles tanto en proyectos independientes como de estudio. Sus créditos en el cine incluyen a Sobreviviendo a la Navidad para el director Mike Mitchell, la comedia de la DreamWorks El reportero: La leyenda de Ron Burgundy, de Lionsgate Érase una vez, de Miramax View From the Top, y No le digas a mamá que la canguro ha muerto.

Applegate al principio se ganó la simpatía del público como la sexy y sarcástica Kelly Bundy en la veterana serie de la Fox, "Matrimonio con hijos". Después de 11 exitosas temporadas, aumentó su éxito televisivo interpretando su propia serie de comedia en la NBC, "Jesse." En 1999, la muy apreciada serie le supuso a Applegate un premio People´s Choice Award como Intérprete Femenina Favorita y una nominación a un Globo de Oro en la categoría de Mejor Interpretación de una Actriz en una Serie, Comedia o Musical de televisión.

En 2004, Applegate volvió a la televisión como estrella invitada en "Friends" interpretando a Amy, la hermana menor de Rachel (Jennifer Aniston). Su interpretación le valió un Emmy Award en la categoría de "Actriz Invitada Sobresaliente en una Serie de Comedia" por su papel. Estuvo nominada a un premio Emmy otra vez al año siguiente por su ingeniosa interpretación.

En 2005, Applegate tuvo su debut en Broadway en la reposición de Sweet Charity, en el papel protagonista de Charity Hope Valentine. Por este papel, Applegate estuvo nominada a un Premio Tony a la Mejor Interpretación de una Actriz Protagonista en un Musical, así como a un Premio Drama Desk Award en la categoría de Actriz Sobresaliente en un Musical. Sweet Charity finalizó su puesta en escena en enero de 2006. Otros créditos suyos en el teatro incluyen una aparición en la producción de Los Ángeles de John Cassavetes The Third Day con Gena Rowlands, The Axeman´s Jazz, Nobody Leaves Empty Handed, The Run-Through, y The Grass Harp.